结核分枝杆菌Rpf-DNA疫苗对Mtb感染小鼠免疫保护作用的研究

摘要/Abstract

摘要： 目的评价Mtb复苏因子DNA疫苗（resuscitation-promoting factor DNA，Rpf-DNA）对Mtb感染宿主的免疫保护作用。方法构建复苏因子D(Rpf D-DNA)和复苏因子E(Rpf E-DNA)质粒疫苗，180只BALB/c小鼠（4周龄）分为6组，每组30只，分别用空质粒、Rpf D-DNA质粒、Rpf E-DNA质粒、BCG、生理盐水免疫,H37Rv标准株气溶胶感染。检测血清复苏因子（Rpf）抗体、IFN-γ；RpfD、E刺激淋巴细胞后进行淋巴细胞增殖、细胞杀伤实验；检测细胞上清IFN-γ、IL-12、IL-2；对肺组织进行病理学检测和细菌负荷（CFU）计数。结果（1）疫苗免疫组血清Rpf D、Rpf E抗体水平：Rpf D组0.32±0.1，Rpf E组0.39±0.1,BCG组0.02±0.01，空质粒组0.01±0.0，生理盐水组0.09±0.04，空白对照组0.03±0.01，RpfD组与RpfE组抗体水平与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有显著统计学意义，F值分别为Rpf D：45.6，43.2，45.1，45.7；Rpf E：51.6，53.6，51.0，52.2；P值均<0.01。血清IFN-γ：Rpf D组（43.9±24.8）pg/ml，Rpf E组（45.9±21.0）pg/ml,BCG组（21.0±11.0）pg/ml，空质粒组（7.9±4.9）pg/ml，生理盐水组（4.7±2.1）pg/ml，空白对照组（5.8±4.7）pg/ml，Rpf D、Rpf E质粒组与BCG组比较差异有统计学意义（F值分别为Rpf D：10.2；Rpf E：12.4；P值均<0.05）, 与空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有显著统计学意义，F值分别为Rpf D：15.6，17.8，17.3；Rpf E：17.5，21.1，20.7；P值均<0.01。（2）淋巴细胞增殖实验CCK-8：Rpf D组176.0±4.2，Rpf E组183.0±4.3,BCG组101.0±1.1，空质粒组100.0±6.8，生理盐水组104.0±8.4，空白对照组116.0±2.2，RpfD、RpfE质粒组与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有统计学意义，F值分别为Rpf D：9.5，10.1，10.0，9.0；Rpf E：11.2，12.9，11.7，10.3；P值均<0.05。细胞杀伤实验：Rpf D组32.0±3.2，Rpf E组30.0±4.2,BCG组16.0±5.9，空质粒组3.3±1.5，生理盐水组6.7±0.5，空白对照组7.3±3.5，Rpf D、Rpf E质粒组与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有统计学意义，F值分别为Rpf D：8.8，14.5，13.7，11.9；Rpf E：8.1，12.5，11.6，11.1；P值均<0.05。（3）Rpf D、Rpf E蛋白各自刺激淋巴细胞后上清细胞因子检测：IL-2：Rpf D组9.5±2.4，Rpf E组9.2±1.2,BCG组2.4±2.1，空质粒组1.2±0.3，生理盐水组1.8±1.0，空白对照组1.5±0.7，Rpf D、Rpf E质粒组与其他各组比较差异有统计学意义，F值分别为Rpf D：12.5，14.6，13.5，13.9；Rpf E：12.0，13.6，13.1，13.2；P值均<0.05。IFN-γ：Rpf D组22.2±5.7，Rpf E组28.7±14.4,BCG组16.1±10.1，空质粒组9.8±1.6，生理盐水组13.2±2.1，空白对照组15.7±2.9，RpfD、RpfE质粒组与其他各组比较差异有统计学意义，F值分别为Rpf D：7.8，12.6，8.7，8.3；Rpf E：11.3，16.4，14.7，14.2；P值均<0.05。结论实验表明复苏因子疫苗能诱导Mtb感染小鼠产生体液免疫和细胞免疫，有希望成为结核病候选疫苗之一。

关键词: 分枝杆菌, 结核, 细菌蛋白质类, 细胞因子类, 疫苗, DNA

Abstract: Objective To evaluate the immune protective effect of resuscitation promoting factor (Rpf) DNA vaccine on M. tuberculosis (Mtb) infected mice. Method Rpf D and Rpf E plasmid DNA vaccines were construct. 180 BALB/c mice with 4 weeks of age were divided into 6 groups, 30 mice each group were immunized with empty plasmid, Rpf D plasmid DNA, Rpf E plasmid DNA, BCG and saline, respectively. All of mice were infected by aerosol with Mtb H37Rv. Serum anti-Rpf D or E antibodies and IFN-γ were detected. The lymphocyte proliferation assay and cytotoxicity test were performed, IFN-γ, IL-12 and IL-2 levels were tested after immunization with RpfD,E DNA vaccine. Histopathologic examination of the lung and CFU count were performed. Results (1) The antibody levels against RpfD and E were as follow：Rpf D group 0.32±0.1，Rpf E group 0.39±0.1,BCG group 0.02±0.01，empty plasmid group 0.01±0.0，saline group 0.09±0.04，blank group 0.03±0.01.The antibody levels in RpfD group and E group were significantly higher than those in BCG group，empty plasmid group, saline group, and blank group (F value: Rpf D：（45.6，43.2，45.1，45.7）；Rpf E：（51.6，53.6，51.0，52.2）; P<0.01). Serum IFN-γ levels: Rpf D group (43.9±24.8）pg/ml，Rpf E group (45.9±21.0）pg/ml,BCG group (21.0±11.0）pg/ml，empty plasmid group (7.9±4.9）pg/ml，Saline group (4.7±2.1）pg/ml，blank group (5.8±4.7）pg/ml，Serum IFN-γ levels of RpfD group and E group were higher than empty plasmid group, saline group, and blank group (F value: Rpf D：15.6，17.8，17.3；Serum IFN-γ levels of Rpf E：17.5，21.1，20.7; P<0.01). (2) The lymphocyte proliferation assay using cell counting kit-8 (CCK-8) showed: Rpf D group 176.0±4.2，Rpf E group 183.0±4.3,BCG group 101.0±1.1，empty plasmid group 100.0±6.8，saline group 104.0±8.4，blank group 116.0±2.2, which in vaccine groups were significantly higher than the other controls (F value: Rpf D：9.5，10.1，10.0，9.0；Rpf E：11.2，12.9，11.7，10.3，P<0.05). Cytotoxicity test showed: Rpf D group 32.0±3.2，Rpf E group 30.0±4.2,BCG group 16.0±5.9，empty plasmid group 3.3±1.5，saline group 6.7±0.5，blank group 7.3±3.5. The proliferation index in RpfD group and RpfE group was higher than the other control groups (F value Rpf D：8.8，14.5，13.7，11.9；Rpf E：8.1，12.5，11.6，11.1; P<0.05). (3) Cytokines in the supernatant of lymphocytes stimulated by Rpf D and Rpf E:IL-2 level: Rpf D group 9.5±2.4，Rpf E group 9.2±1.2,BCG group 2.4±2.1，empty plasmid group 1.2±0.3，saline group 1.8±1.0，blank group 1.5±0.7. The IL-2 levels in RpfD group and RpfE group were higher than the other control groups (F value Rpf D：12.5，14.6，13.5，13.9；Rpf E：12.0，13.6，13.1，13.2; P<0.05). IFN-γ level: Rpf D group 22.2±5.7，Rpf E group 28.7±14.4,BCG group 16.1±10.1，empty plasmid group 9.8±1.6，saline group 13.2±2.1，blank group 15.7±2.9. The IFN-γ level in RpfD group and RpfE group were higher than the other control groups（F value Rpf D：7.8，12.6，8.7，8.3；Rpf E：11.3，16.4，14.7，14.2; P<0.05）. Conclusion RpfD and RpfE DNA vaccines can induce immune responses including humoral and cellular immunogenicity in Mtb infected BALB/c mice. Rpf might be used as the vaccine candidate.

Key words: Mycobacterium tuberculosis, Bacterial proteins, Cytokines, Vaccines,DNA

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