实时荧光定量PCR检测不同结核标本及其联合玻璃珠磨菌法检测价值的初步研究

doi:10.19982/j.issn.1000-6621.20210584

中国防痨杂志 ›› 2022, Vol. 44 ›› Issue (5): 450-454.doi: 10.19982/j.issn.1000-6621.20210584

实时荧光定量PCR检测不同结核标本及其联合玻璃珠磨菌法检测价值的初步研究

戴广明¹^,², 王芬²^,³, 曹廷明¹^,², 褚洪迁¹^,², 黄海荣²^,³, 孙照刚¹^,²()

¹首都医科大学附属北京胸科医院转化医学研究室,北京 101149
²北京市结核病胸部肿瘤研究所耐药结核病研究北京市重点实验室,北京 101149
³首都医科大学附属北京胸科医院国家结核病临床实验室,北京 101149

收稿日期:2021-09-27 出版日期:2022-05-10 发布日期:2022-05-04
通信作者: 孙照刚 E-mail:sunzg75@163.com
基金资助:
北京市教育委员会科研计划项目(KZ202110025034);北京市科委首都特色基金重点项目(Z211100002921002)

Study on efficiency of Mycobacterium tuberculosis detection by real-time quantitative PCR with different clinical sample types and the improvement by grinding specimen with glass beads

DAI Guang-ming¹^,², WANG fen²^,³, CAO Ting-ming¹^,², CHU Hong-qian¹^,², HUANG Hai-rong²^,³, SUN Zhao-gang¹^,²()

¹Translational Medicine Center, Beijing Chest Hospital, Capital Medical University, Beijing 101149, China
²Beijing Key Laboratory in Drug Resistant Tuberculosis Research, Beijing Tuberculosis and Thoracic Tumor Research Institute, Beijing 101149, China
³National Tuberculosis Clinical Laboratory, Beijing Chest Hospital, Capital Medical University, Beijing 101149, China

Received:2021-09-27 Online:2022-05-10 Published:2022-05-04
Contact: SUN Zhao-gang E-mail:sunzg75@163.com
Supported by:
Scientific Research Program of Beijing Municipal Commission of Education(KZ202110025034);Beijing Municipal Science & Technology Commission(Z211100002921002)

摘要/Abstract

摘要：

目的: 探索实时荧光定量PCR(qRT-PCR)联合玻璃珠磨菌法对检测不同临床标本中结核分枝杆菌菌载量的优化作用。方法: 回顾性搜集2008年1月1日至2016年12月31日首都医科大学附属北京胸科医院住院和门诊诊治的疑似结核病患者11570份不同临床标本的qRT-PCR检测结果并进行分析,主要包括痰液1487份、脓液273份、脑脊液1391份、气管(支气管)肺泡灌洗液41份和血液4650份等。再通过建立伪随机函数的方法从中选取82份临床诊断为肺结核的痰液标本,对其进行玻璃珠(直径0.3mm)振荡磨菌前后qRT-PCR定量检测效果分析。结果: 11570份不同临床标本的总检测阳性率为12.16%(1407/11570)。其中,气管(支气管)灌洗液的检出率最高[36.59%(15/41)],以门诊患者来源的阳性率最高[43.48%(10/23)];其次是脓液标本[35.53%(97/273)],以住院患者来源的阳性率最高[36.26%(95/262)];痰液标本位居第三[30.33%(451/1487)];其他标本阳性率介于10.43%(485/4650)~15.03%(209/1391)之间。对选取的82份痰标本行5min的玻璃珠磨菌处理后,qRT-PCR检测的核酸浓度[44.45(9.05,71.62)×10⁷拷贝/ml]较处理前[4.03(1.87,5.92)×10⁷拷贝/ml]明显提高,差异有统计学意义(Z=2.120,P=0.016)。其中,有28份(34.15%)痰标本提高了菌株数量级,尤其是21份含菌量为10²拷贝/ml的临床痰标本经振荡研磨后有14份(66.67%)提升到了10³拷贝/ml菌量数量级,使阳性检出率由磨菌处理前的60.98%(50/82)提高到磨菌处理后的78.05%(64/82)。结论: qRT-PCR对灌洗液、脓液和痰液标本中结核分枝杆菌的检出率高,在其他标本中检出率低。采用玻璃珠振荡磨菌处理后可提高临床标本的阳性检出率。

关键词: 分枝杆菌,结核, 分子诊断技术, 实验室技术和方法, 评价研究

Abstract:

Objective: To explore a method with improved efficiency for quantitatively detecting Mycobacterium tuberculosis (MTB) in different type of clinical samples by combining glass beads grinding with real-time quantitative PCR (qRT-PCR). Methods: A retrospective study was performed in Beijing Chest Hospital. Data of qRT-PCR examination performed between Jan. 1st, 2008 and Dec. 31th 2016 were retrieved. The outcomes of 11570 clinical specimens collected from tuberculosis suspects of inpatients and outpatients were acquired, including 1487 sputa, 273 purulent specimens, 1391 cerebrospinal fluids (CSF), 41 bronchoalveolar lavage fluids (BALF), and 4650 blood samples. Furthermore, 82 specimens collected from pulmonary tuberculosis patients were chosen by pseudorandom function, the quantitative outcomes were compared between the procedures with or without grinding with glass beads (diameter 0.3 mm). Results: The overall positive rate of the different clinical specimen types was 12.16% (1407/11570). Among them, BALF acquired the highest positive rate (36.59% (15/41)), and the outpatients had higher positive rate (43.48% (10/23)). The second highest positive rate was among purulent specimens (35.53%(97/273)), of which the inpatients yielded higher positive rate (36.26% (95/262)). The positive rate of sputa ranked the third (30.33% (451/1487)). The positive rate of the other leftover samples ranged over 10.43% (485/4650)-15.03% (209/1391). In contrast to the method without grinding, the nucleic acid quantity of the specimen grinded by class beads increased evidently (44.45 (9.05,71.62)×10⁷ copy/ml vs. 4.03 (1.87,5.92)×10⁷ copy/ml; Z=2.120, P=0.016). Additionally, 28 (34.15%) samples produced one order of magnitude increase outcomes, 66.67% (14/21) samples from 10² copy/ml to 10³ copy/ml by using glass bead grinding. Hence, the positive rate of the selected 82 specimens increased from 60.98% (50/82) to 78.05% (64/82). Conclusion: qRT-PCR had higher detection rates in BALF, pus and sputa than other sample types. Grinding specimen by glass bead could improve the positive detection rate.

Key words: Mycobacterium tuberculosis, Molecular diagnostic techniques, Laboratory techniques and procedures, Evaluation studies

中图分类号:

R52
R446

戴广明, 王芬, 曹廷明, 褚洪迁, 黄海荣, 孙照刚. 实时荧光定量PCR检测不同结核标本及其联合玻璃珠磨菌法检测价值的初步研究[J]. 中国防痨杂志, 2022, 44(5): 450-454. doi: 10.19982/j.issn.1000-6621.20210584

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图/表 4

表1

表2

表3

H37Rv标准株和涂片“+”痰液标本经振荡研磨处理后不同时间的检测情况

检测菌株	0min	1min	2min	3min	4min	5min	6min
H37Rv标准株(×10⁷ 拷贝/ml, $x ¯$ ±s)	4.55±1.02	4.88±1.11	4.68±0.97	4.77±1.42	5.09±1.44	5.22±1.32	4.93±1.68
涂片(+)痰标本[×10³拷贝/ml,M(Q₁,Q₃)]	1.51(1.68, 2.86)	1.42(1.21, 2.98)	2.06(1.23, 3.46)	2.53(1.86, 3.91)	3.21(2.12, 3.95)	3.87(2.94, 5.09)	3.43(2.35, 4.76)

表3

表4

参考文献 13

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样本类型	门诊患者			住院患者			合计
样本类型	总份数	阳性份数	阳性率 (%)	总份数	阳性份数	阳性率 (%)	总份数	阳性份数	阳性率 (%)
痰液	472	128	27.12	1015	323	31.82	1487	451	30.33
脓液	11	2	18.18	262	95	36.26	273	97	35.53
脑脊液	514	82	15.95	877	127	14.48	1391	209	15.03
腹腔积液	142	10	7.04	163	24	14.72	305	34	11.15
灌洗液	23	10	43.48	18	5	27.78	41	15	36.59
尿液	71	5	7.04	76	14	18.42	147	19	12.93
心包积液	29	4	13.79	59	8	13.56	88	12	13.64
胸腔积液	1307	126	9.64	1881	316	16.80	3188	442	13.86
血液	3653	379	10.38	997	106	10.63	4650	485	10.43
合计	6222	746	11.99	5348	1018	19.04	11570	1407	12.16

样本类型	菌株含量数量级(拷贝/ml)
样本类型	≤10¹	10²	10³	10⁴	10⁵	10⁶	≥10⁷
痰液(1487份)	1007(67.72)	29(1.95)	57(3.83)	123(8.27)	118(7.94)	114(7.67)	39(2.62)
脓液(273份)	175(64.10)	1(0.37)	8(2.93)	21(7.69)	30(10.99)	31(11.36)	7(2.56)
灌洗液(41份)	26(63.41)	0(0.00)	2(4.88)	3(7.32)	5(12.19)	1(2.44)	4(9.76)
脑脊液(1391份)	1161(83.47)	21(1.51)	51(3.67)	65(4.67)	58(4.17)	19(1.36)	16(1.15)
血液(4650份)	4508(96.95)	14(0.30)	28(0.60)	40(0.86)	32(0.69)	19(0.41)	9(0.19)
胸腔积液(3188份)	2681(84.10)	65(2.04)	128(4.02)	136(4.26)	81(2.54)	55(1.72)	42(1.32)
腹腔积液(305份)	264(86.56)	7(2.29)	12(3.93)	10(3.28)	7(2.30)	2(0.66)	3(0.98)
尿液(147份)	125(85.04)	3(2.04)	3(2.04)	7(4.76)	3(2.04)	5(3.40)	1(0.68)
心包积液(88份)	74(84.09)	2(2.27)	6(6.82)	3(3.41)	0(0.00)	2(2.27)	1(1.14)

检测结果	菌株含量数量级(拷贝/ml)
检测结果	<10¹	10²	10³	10⁴	10⁵	10⁶	10⁷
磨菌前浓度[×10⁷拷贝/ml,M(Q₁,Q₃)]	0	4.61(2.14, 7.21)	4.03(1.87, 5.92)	3.35(1.45, 6.43)	4.28(2.52, 6.72)	2.99(1.43, 4.88)	3.09(2.50, 4.66)
磨菌后浓度[×10⁷拷贝/ml,M(Q₁,Q₃)]	0	16.91(8.46, 20.12)	44.45(9.05, 71.62)	12.89(7.80, 36.81)	9.07(4.69, 9.83)	7.11(4.18, 9.75)	6.95(4.66, 8.34)
磨菌前份数	11	21	12	15	9	8	6
磨菌后份数	11	7	19	18	11	9	7
改善份数(改善率,%)]	0(0.00)	14(66.67)	7(58.33)	3(20.00)	2(2/9)	1(1/8)	1(1/6)

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实时荧光定量PCR检测不同结核标本及其联合玻璃珠磨菌法检测价值的初步研究

Study on efficiency of Mycobacterium tuberculosis detection by real-time quantitative PCR with different clinical sample types and the improvement by grinding specimen with glass beads

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