荧光PCR探针熔解曲线技术和DNA微阵列芯片技术鉴定分枝杆菌菌种的研究

doi:10.19982/j.issn.1000-6621.20250054

摘要/Abstract

摘要：

目的: 研究荧光PCR探针熔解曲线技术(简称“熔解曲线法”)和DNA微阵列芯片技术(简称“基因芯片法”)在分枝杆菌菌种鉴定方面的临床应用价值。方法: 选取熔解曲线法和基因芯片法检测范围内的分枝杆菌标准菌株,以及2016年1月至2023年8月北京市疾病预防控制中心结核病实验室保存的疑似非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacterium, NTM)的临床分离菌株,采用2种方法进行检测分析,对检测异常的菌株进行全基因组测序分析。结果: 共选取19种分枝杆菌标准菌株,每种各1株;采用熔解曲线法和基因芯片法对标准菌株进行检测,符合率均为100.00%;收集到临床分离菌株180株,经熔解曲线法和基因芯片法鉴定为结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex, MTB)的菌株8株,1株MTB合并偶发分枝杆菌,NTM菌株171株。2种方法检测临床分离菌株的一致率为87.78%(158/180);检测一致的149株NTM菌株中,占比前4位的依次为鸟分枝杆菌复合群(MAC)[38.26%(57/149)]、龟分枝杆菌或脓肿分枝杆菌[24.83%(37/149)]、堪萨斯分枝杆菌[17.45%(26/149)]、偶发分枝杆菌[12.75%(19/149)]。2种方法鉴定结果不同的菌株22株,9株为MAC;1株基因芯片法鉴定为胞内分枝杆菌,熔解曲线法鉴定为慢生黄分枝杆菌;1株基因芯片法鉴定为土分枝杆菌,熔解曲线法鉴定为不产色分枝杆菌。10株基因芯片法有菌种鉴定结果,熔解曲线法无法判读;1株基因芯片法无法判读,熔解曲线法判读为慢生黄分枝杆菌。采用全基因组测序计算平均核苷酸一致性(average nucleotide identity,ANI),检测出爱知戈登氏菌(ANI=99.102)、沃林斯基分枝杆菌(ANI=97.822)、慕里黑分枝杆菌(ANI=97.365)、外来分枝杆菌(ANI=97.730/97.981/96.930)、大口非鲫分枝杆菌(ANI=96.277)。结论: 熔解曲线法和基因芯片法在分枝杆菌菌种鉴定方面均具有较好的临床应用价值,且熔解曲线法鉴定结果准确度更高。

关键词: 分枝杆菌感染, 分枝杆菌,结核, 分子探针技术, 诊断, 鉴别

Abstract:

Objective: To compare the clinical application value of fluorescent PCR probe melting curve assay (MeltPro) and DNA microarray chip technique for the Mycobacterium species identification. Methods: We collected the reference strains within the detection scope of both methods and the clinical isolates suspected to be nontuberculosis mycobacteria (NTM) stored in the Tuberculosis Laboratory the Beijing Center for Disease Control and Prevention from January 2016 to August 2023, and used the two methods for species identification. Strains yielding discrepant results underwent whole-genome sequencing analysis. Results: A total of 19 reference strains (one per species) were selected, with both the Melting Curve Method and the Gene Chip Method achieving a 100.00% concordance rate for their identification. A total of 180 clinical strains were collected, of which 8 strains were identified as Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC), 1 strain showed the MTBC co-occuring with Mycobacterium fortuitum, and 171 strains were identified as NTM. The overall concordance rate between the two methods for clinical strains was 87.78% (158/180). The top four species by prevalence were Mycobacterium avium intracelluar complex (MAC)(38.26% (57/149)), Mycobacterium chelonae or Mycobacterium abscess (24.83% (37/149)), Mycobacterium kansas (17.45% (26/149)), and Mycobacterium fortuitum (12.75% (19/149)) in 149 NTM strains. Discrepant results occurred in 22 strains: 9 showed MAC discordance between two methods, 1 strain was identified as an Mycobacterium intracellulare using the DNA microarray chip technique, but as Mycobacterium lentiflavum by MeltPro,1 strain was identified as an Mycobacterium terrae using the DNA microarray chip, and as Mycobacterium nonchromogenicum by MeltPro, 10 strains had the identification results by DNA microarray chip, but yielded uninterpretable results by MeltPro, and 1 strain was uninterpretable by DNA microarray chip, but identified as Mycobacterium lentiflavum by MeltPro. Gordonia aichiensis (ANI=99.102),Mycobacterium wolinskyi (ANI=97.822),Mycobacterium monacense (ANI=97.365),Mycobacterium peregrinum (ANI=97.730/97.981/96.930) and Mycobacterium stomatepiae (ANI=96.277) were identified by WGS and calculation of Average Nucleotide Identity(ANI). Conclusion: Both the MeltPro assay and DNA microarray chip method demonstrate good clinical application value for the identification of Mycobacterium species; however, the MeltPro assay exhibits higher accuracy.

Key words: Mycobacterium infections, Mycobacterium tuberculosis, Molecular probe techniques, Diagnosis, differential

中图分类号:

R372
R446

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图/表 4

表1

表2

表3

表4

参考文献 23

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标准菌株	基因芯片结果	熔解曲线结果
蟾蜍分枝杆菌(ATCC19250)	蟾蜍分枝杆菌	蟾蜍分枝杆菌
戈登分枝杆菌(ATCC14470)	戈登分枝杆菌	戈登分枝杆菌
耻垢分枝杆菌(ATCC19420)	耻垢分枝杆菌	耻垢分枝杆菌
鸟分枝杆菌(ATCC25291)	鸟分枝杆菌	鸟分枝杆菌
马尔摩分枝杆菌(ATCC29571)	苏加分枝杆菌加或马尔摩分枝杆菌	马尔摩分枝杆菌
瘰疬分枝杆菌(ATCC19981)	瘰疬分枝杆菌	瘰疬分枝杆菌
偶发分枝杆菌(ATCC6841)	偶发分枝杆菌	偶发分枝杆菌
苏加分枝杆菌(ATCC35799)	苏加分枝杆菌或马尔摩分枝杆菌	苏加分枝杆菌
猿猴分枝杆菌(ATCC25275)	无法判读	猿猴分枝杆菌
海分枝杆菌(ATCC927)	海分枝杆菌或溃疡分枝杆菌	海或溃疡分枝杆菌
脓肿分枝杆菌(ATCC19977)	龟分枝杆菌或脓肿分枝杆菌	脓肿分枝杆菌
草分枝杆菌(ATCC11758)	草分枝杆菌	分枝杆菌属
浅黄分枝杆菌(ATCC43909)	浅黄分枝杆菌	分枝杆菌属
不产色分枝杆菌(ATCC19530)	不产色分枝杆菌	不产色分枝杆菌
土分枝杆菌(ATCC15755)	土分枝杆菌	土分枝杆菌
堪萨斯分枝杆菌(ATCC12478)	堪萨斯分枝杆菌	堪萨斯分枝杆菌
胞内分枝杆菌(ATCC13950)	胞内分枝杆菌	胞内分枝杆菌
龟分枝杆菌(ATCC35752)	龟分枝杆菌或脓肿分枝杆菌	龟分枝杆菌
结核分枝杆菌(H37Rv)	结核分枝杆菌复合群	结核分枝杆菌复合群

菌种		基因芯片法		熔解曲线法
菌种		株数	构成比(%, 95%CI)	株数	构成比(%, 95%CI)
结核分枝杆菌复合群		8	4.44(2.28~8.75)	8	4.44(2.28~8.75)
结核分枝杆菌复合群合并偶发分枝杆菌		1	0.56(0.10~3.10)	1	0.56(0.10~3.10)
缓慢生长型
胞内分枝杆菌		50	27.78(20.87~33.75)	53	29.44(23.41~33.67)
鸟分枝杆菌		14	7.78(4.71~12.7)	12	6.67(3.87~11.35)
鸟分枝杆菌+胞内分枝杆菌		3	1.67(0.57~4.82)	1	0.56(0.10~3.10)
堪萨斯分枝杆菌		27	15.00(10.57~21.05)	26	14.44(10.11~20.44)
慢生黄分枝杆菌		0	0.00(0.00~2.10)	2	1.11(0.31~3.99)
不产色分枝杆菌		0	0.00(0.00~2.10)	1	0.56(0.10~3.10)
戈登分枝杆菌		3	1.67(0.57~4.82)	3	1.67(0.57~4.82)
土分枝杆菌		2	1.11(0.31~3.99)	1	0.56(0.10~3.10)
蟾蜍分枝杆菌		1	0.56(0.10~3.10)	1	0.56(0.10~3.10)
快速生长型
龟分枝杆菌或脓肿分枝杆菌	37		20.56(15.38~27.19)	0	0.00
龟分枝杆菌	0		0.00	5	2.78(1.20~6.37)
脓肿分枝杆菌	0		0.00	32	17.78(12.96~24.15)
偶发分枝杆菌	23		12.78(8.72~18.54)	19	10.56(6.90~15.98)
耻垢分枝杆菌	3		1.67(0.57~4.82)	0	0.00(0.00~2.10)
浅黄分枝杆菌	2		1.11(0.31~3.99)	0	0.00(0.00~2.10)
分枝杆菌属(无法判读)	6		3.33(1.54~7.12)	15	8.33(5.14~13.36)
合计	180		100.00	180	100.00

菌种	菌株株数	构成比(%, 95%CI)
鸟分枝杆菌复合群(MAC)	57	38.26(29.34~48.05)
龟分枝杆菌或脓肿分枝杆菌	37	24.83(17.40~34.12)
堪萨斯分枝杆菌	26	17.45(11.26~26.05)
偶发分枝杆菌	19	12.75(7.57~20.69)
戈登分枝杆菌	3	2.01(0.55~7.02)
蟾蜍分枝杆菌	1	0.67(0.09~4.90)
土分枝杆菌	1	0.67(0.09~4.90)
分枝杆菌属	5	3.36(1.21~8.96)
合计	149	100.00

序号	熔解曲线结果	基因芯片结果		全基因组测序结果
序号	熔解曲线结果	基因芯片结果		菌种		ANI值
1	分枝杆菌属		不在17种范围内		爱知戈登氏菌		99.102
2	分枝杆菌属		不在17种范围内		-		-
3	分枝杆菌属		不在17种范围内		外来分枝杆菌		96.930
4	分枝杆菌属		不在17种范围内		沃林斯基分枝杆菌		97.822
5	分枝杆菌属		不在17种范围内		科曼尼分枝菌酸杆形菌		90.308
6	分枝杆菌属		耻垢分枝杆菌		慕里黑分枝杆菌		97.365
7	分枝杆菌属		耻垢分枝杆菌		田野分枝杆菌		83.479
8	分枝杆菌属		耻垢分枝杆菌		-		-
9	分枝杆菌属		偶发分枝杆菌		外来分枝杆菌		97.730
10	分枝杆菌属		偶发分枝杆菌		外来分枝杆菌		97.981
11	分枝杆菌属		偶发分枝杆菌		败血症分枝杆菌		88.136
12	分枝杆菌属		偶发分枝杆菌		产黏液分枝杆菌		93.564
13	分枝杆菌属		浅黄分枝杆菌		-		-
14	分枝杆菌属		浅黄分枝杆菌		-		-
15	分枝杆菌属		堪萨斯分枝杆菌		-		-
16	慢生黄分枝杆菌		不在17种范围内		大口非鲫分枝杆菌		96.277
17	不产色分枝杆菌		土分枝杆菌		-		-