doi:10.19982/j.issn.1000-6621.20261001

Abstract

CLC Number:

R372

Figures/Tables 4

技术名称	原理	技术特点	临床应用
实时荧光PCR 技术	在PCR反应体系中加入荧光基团,通过实时监测PCR过程中积累的荧光信号,对起始模板进行定量分析。包括非特异性检测(DNA结合染料法)和特异性检测(荧光探针法)	敏感度高、可定量,需防止假阳性。根据配套检测的仪器设备,可实现高通量、高自动化,全程封闭及实时在线检测,自动输出结果	菌种鉴定、耐药性检测等
等温扩增技术	以RNA或者DNA为靶标和扩增子,在恒温条件下,利用多种酶(如逆转录酶和RNA聚合酶或链置换DNA聚合酶)的协同作用,精心设计多条引物,将靶RNA序列或者DNA序列进行指数级扩增,并通过实时荧光探针进行检测,从而实现MTB的极高灵敏度和特异性检测	在等温条件下完成DNA扩增,根据检测起始核酸类型,包括DNA和RNA,其中RNA检测需要先逆转录cDNA,再行DNA扩增。其简单、快速,特异性高	结核分枝杆菌RNA或者DNA核酸检测
巢式PCR技术	通过两轮连续扩增(先外侧引物预扩增大片段,再内侧引物特异性扩增目标小片段),实现双重筛选	二次扩增,提高敏感度和特异度	菌种鉴定、耐药性检测等
多重PCR技术	在一个单一的PCR反应体系中,加入多对引物,同时扩增多个不同的目标DNA序列	多靶标检测,提高检测覆盖病原体数量	菌种鉴定、多种耐药突变同时检测等
数字PCR技术	将一份样品分成成千上万个微小的独立反应单元,让每个单元包含0个、1个或几个目标分子,然后对每个单元进行独立的PCR扩增,最后通过计数“有信号”的单元数量,直接计算出目标分子的绝对拷贝数	可实现绝对定量,且敏感度极高	菌种鉴定、耐药性检测等,在低菌量标本检测与精确定量、低频耐药突变检测方面有优势
逆转录PCR 技术	以RNA为起始模板,先通过逆转录过程将其互补成cDNA(complementaryDNA),再以cDNA为模板进行普通的PCR扩增。该技术将微量RNA信号放大到足以进行检测和分析的水平	先将RNA逆转录为DNA,再进行PCR扩增	结核分枝杆菌RNA检测
基于荧光探针熔解曲线的多重PCR技术	一种基于实时荧光PCR的衍生技术,用于在扩增反应结束后,通过测量荧光值随温度变化的情况来区分不同的扩增产物	高特异性,扩增和检测在同一反应管中进行,成本低,可同时实现菌种鉴定和耐药筛查	菌种鉴定、多种耐药突变检测
基因芯片技术	基于碱基互补配对核酸杂交原理,结合高通量、并行化的检测方式,实现了对大量基因信息的同时分析	短时间内可同时检测多种耐药性,以及MTBC和常见分枝杆菌,通量高	菌种鉴定、多种耐药突变检测
线性探针技术 (LPA)	与传统的将标本DNA固定在膜上、用探针杂交的方式相反,LPA是将多种特异性探针固定在膜条上,然后用标记的标本DNA去杂交	短时间内可同时检测多种耐药性,以及结核分枝杆菌复合群,特异性高	菌种鉴定、多种耐药基因突变检测
一代测序 (Sanger测序)	利用双脱氧核苷酸(ddNTPs)随机终止DNA链延伸,产生不同长度的片段,通过毛细管电泳分离并读取序列	准确性极高(金标准)、读长较长(可达1000bp),但通量低、成本高且无法检测低频突变(<20%),对于分枝杆菌混合感染的标本,可能存在漏检	主要用于分枝杆菌的菌种鉴定、耐药突变确认等
全基因组测序技术(WGS)	通过对分枝杆菌的整个基因组进行断裂、测序和重组装,获取其全部的遗传密码(约440万个碱基对),并将其与参考基因组比对,以识别所有的遗传变异	提供最全面、最完整的遗传信息,以及已知和未知的耐药相关突变。当前仅用于纯培养物检测。价格较贵,报告周期较长	菌种鉴定及耐药谱预测、基因分型与溯源、异质耐药检测。它被视为菌种鉴定、耐药性预测和分子流行病学研究的“金标准”
宏基因组二代测序(mNGS)	通过高通量测序技术直接检测标本中所有微生物的DNA/RNA,无需预设病原体,通过比对数据库识别病原体。其核心原理是通过随机引物扩增标本中的核酸,结合生物信息学分析,检测多种病原体	优势:广谱病原体覆盖能力,对混合感染、罕见病原体及疑难感染(如FUO)提供快速诊断线索。局限:分枝杆菌检出率受核酸丰度、数据库完整性限制;阴性结果不能排除感染;需结合培养/PCR验证结果;成本较高、周期较长	用于在分枝杆菌合并其他病原体感染的诊断,尤其是合并罕见病原体感染
靶向二代测序技术(tNGS)	通过PCR或探针捕获的方法富集分枝杆菌基因组中与耐药性和菌种鉴定相关的特定目标区域,然后对这些富集后的片段进行高通量测序,从而高效、精准地获取关键基因的序列信息	极高的检测深度和敏感度,通量大、数据量小,通过特异性引物或者探针富集,可定制化系列检测靶标。较mNGS测序成本更低,且操作更简便,适合大规模临床应用。可快速完成耐药性检测和病原体鉴定,缩短诊断时间	耐药性检测、菌种鉴定
纳米孔测序技术	不依赖于PCR扩增、荧光标记或合成反应,而是直接测量单分子DNA或RNA通过微小孔道时引起的电信号变化	超长读长、测序时间短、高通量、直接对DNA和RNA天然序列测序,高敏感度,携带方便,但原始错误率较高,同时数据分析复杂,对生物信息学分析能力要求高	菌种鉴定、耐药性检测、监测病原传播和溯源

复杂程度	应用场景	适用标本类型	实验室要求	人员要求	操作步骤	标本前处理	检测过程	结果输出方式	技术类别^a
低复杂度	基层医院或者实验室功能布局少的医疗机构	常见临床采集标本	无需PCR实验室	普通实验室人员经过简单培训后,可进行操作	操作仅分为标本前处理和上机检测	标本前处理仅需将标本前处理液与临床标本简单混合处理即可	检测过程全封闭,无需对扩增体系进行开盖加成分操作	检测过程实时监测,自动输出结果或者通过肉眼与阴阳性对照对比,即可获得结果	等温扩增(DNA)、快速实时荧光定量PCR便携式系统
中等复杂度	实验室布局较完善,且设置PCR实验室	常见临床采集标本或者纯培养物	需生物安全实验室及PCR实验室	实验人员需经过严格、系统培训后才可进行实验操作	操作分为标本前处理,配制扩增体系,模板与扩增体系混合后,上机操作	标本需经多个步骤处理,获得提取的核酸	检测过程全封闭或者需加入扩增体系中其他引物或者成分,进行开盖操作	检测过程实时监测,自动输出结果	多重PCR、等温扩增(RNA)、线性探针技术、基因芯片技术、熔解曲线技术
高等复杂度	实验室布局较完善,且设置PCR实验室,配备特殊的仪器设备及平台	常见临床采集标本或者纯培养物	需生物安全实验室及PCR实验室	实验人员需经过培训后,才可进行实验操作,对特殊仪器操作及生物信息学分析要求较高	操作分为标本前处理,配制扩增体系,模板与扩增体系混合(或需制备特殊扩增模式),开放操作;尤其是标本文库制备要求较高	标本需经多个步骤处理,获得提取的核酸	检测过程全封闭或者需加入扩增体系中其他引物或者成分,进行开盖操作	检测过程实时监测,自动输出结果或者输出FASTA文件后,通过生物信息学分析软件分析,获得相应结果	数字PCR、巢式PCR、逆转录PCR、测序技术

References 13

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报告结果	光学显微镜(100倍)	荧光显微镜(40倍)
抗酸杆菌阴性	0条/300个视野	0条/50个视野
抗酸杆菌±(报告细菌数量)	(1~8条)/300个视野	(1~9条)/50个视野
抗酸杆菌阳性1+	(3~9条)/100个视野,连续观察300个视野	(10~49条)/50个视野
抗酸杆菌阳性2+	(1~9条)/10个视野,连续观察100个视野	(1~9条)/1个视野,至少观察50个视野
抗酸杆菌阳性3+	(1~9条)/1个视野	(10~99条)/1个视野,至少观察20个视野
抗酸杆菌阳性4+	≥10条/1个视野	≥100条/1个视野,至少观察20个视野

推荐药物^a中文名	推荐药物英文名	推荐药物英文缩写	推荐级别	推荐浓度范围/(mg/L)
利福平	Rifampicin	RFP	最高	0.016~2
异烟肼	Isoniazid	INH	最高	0.016~2
左氧氟沙星	Levofloxacin	Lfx	最高	0.006~8
贝达喹啉	Bedaquiline	Bdq	最高	0.0008~1
利奈唑胺	Linezolid	Lzd	最高	0.06~4
氯法齐明	Clofazimine	Cfz	最高	0.0008~1
德拉马尼	Delamanid	Dlm	最高	0.002~0.25
乙胺丁醇	Ethambutol	EMB	较高	0.125~8
D-环丝氨酸	D-cycloserine	DCs	较高	1~64
乙硫异烟胺	Ethionamide	Eto	较高	0.125~16
卡那霉素	Kanamycin	Km	一般^b	0.125~16

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